HIS標簽親和純化實驗步驟

His標簽是目前蛋白表達中最常用的標簽,而且很成熟,它的優點是表達方便而且基本不影響蛋白的活性,無論是表達的蛋白是可溶性的或者包涵體都可以用固定金屬離子親和色譜去(IMAC)進行蛋白純化下載

Ni柱的選擇

鎳離子有六個螯合價位,Ni-NTA螯合了四價,剩余兩價;而Ni-IDA螯合三價,剩余三價。因此Ni-IDA結合作用力要比Ni-NTA 強,在同樣條件下Ni-IDA 的載量要比Ni-NTA高,而且洗脫雜質和目標蛋白所用的緩沖液中咪唑濃度更高;但Ni-NTA更穩定,耐受更強的還原劑,鎳離子更不易脫落。鎳結構

破碎方法

樣品的處理對純化是很重要的,重要的原則是破碎要溫和,不能使蛋白斷裂或者降解,否則一些片段同樣也帶有標簽,這樣增加了純化的難度。需要注意的問題是超聲破碎溫度,強度,時間。

his標簽親和純化

可溶性蛋白的破碎

  1. 收集培養發酵液,20℃,5000rpm離心8分鐘,沉淀轉移到離心管中,10℃,13000rpm離心1分鐘,收集沉淀的菌體(如果不是馬上破碎可以放-20度冷凍。)
  2. 取8-10克菌體加40-50ml破碎緩沖液(例:20mM Tris,pH8.0,0.15M NaCl,1%Triton X-100,pH8.0)。加入Leupeptin與Pepstantin終濃度1ug/ml,加入TCEP終濃度1mM/ml。
  3. 把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎,超聲3S,間隔8S。超聲15-20Min。(超聲完全的判斷:溶液中有無塊狀物,溶液的黏稠度)
  4. 破碎的液4℃13000rpm離心10分鐘,取上清,再次4℃13000rpm離心10分鐘,然后把上清和沉淀分別留樣,先做上清純化,如果只沉淀中有目標蛋白,那就用變性條件下去提取。
  5. 取純化Ni柱,清洗干凈柱子,加入3-4ml鎳瓊脂糖凝膠,用洗瓶清洗柱子5次,再用平衡液平衡柱子2次(PS:平衡液即破碎液,但不含有Triton X-100。)
  6. 將柱子和上清充分結合,放置四維旋轉混勻器上孵育1-2h后拿出純化

可溶性蛋白的純化

  1. 平衡緩沖液:pH8.0的50mM Tris緩沖液含0.15M NaCl,含20mM咪唑。
  2. 洗脫緩沖液:① pH8.0的50mM Tris緩沖液含0.15M NaCl,含50mM咪唑。
    ② pH8.0的50mM Tris緩沖液含0.15M NaCl,含100mM咪唑。
    ③ pH8.0的50mM Tris緩沖液含0.15M NaCl,含300mM咪唑。
  3. 過柱,流出FT,取樣FT。
  4. 用20倍柱體積平衡緩沖液洗去未吸附的樣品,流速1-2ml/min,直到流出液點樣G250顯示無藍色是開始洗脫柱子上吸附的蛋白。
  5. 用50mM,100mM,300mM咪唑濃度分階段洗脫柱子,洗脫5-10個柱體積左右(PS:蛋白吸附較多,則用多的洗脫液洗脫。),流速1-2ml/min,4ml/管收集。(收集蛋白起點的確定:紫外分光光度的示數上升較快、考馬斯亮藍G250點樣確定變藍色;收集蛋白終點的確定:考馬斯亮藍G250點樣無明顯藍色,紫外分光光度示數下降平穩。)
  6. 將收集的各濃度梯度洗脫下來的蛋白,取樣,跑SDS-Page。
  7. 根據SDS-Page電泳圖,若有蛋白,則收集蛋白進行透析,若電泳結果無蛋白,而沉淀中有蛋白,則用變性條件下洗沉淀,做沉淀純化。

hia純化實驗流程

包涵體破碎

1、大腸桿菌的破碎方法:
1) 收集培養發酵液,20℃,5000rpm離心8分鐘,沉淀轉移到離心管中,13000rpm,10℃,收集沉淀的菌體(如果不是馬上破碎可以放-20度冷凍。)
2) 取5-10克菌體加40-50ml破碎緩沖液(50mM Tris, pH8.0,0.15M NaCl,1%Triton X-100,pH8.0)加入Leupeptin與Pepstantin終濃度1ug/ml,加入TCEP終濃度1mM/ml。
3) 把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎,超聲3S,間隔8S。超聲15-20Min。(超聲完全的判斷:溶液中有無塊狀物,溶液的黏稠度)
4) 破碎的液4℃13000rpm離心20分鐘,然后把上清和沉淀分別留樣,取沉淀。
5) 沉淀加入再次破碎緩沖液( pH8.0,50mM Tris,2mM EDTA,150mM NaCl,20mM咪唑,1% Triton X-100。)把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎,超聲3S,間隔8S。超聲15-20Min。
6) 破碎的液4℃13000rpm離心20分鐘,取沉淀。(PS:沉淀中不能含有溶液,所以必須要倒干凈。)
7) 破碎離心的沉淀先加緩沖液(20mM咪唑,20mMTris,pH8.0)1ml溶解沉淀,加變性溶液( pH8.0的50mMTris緩沖液含0.15 NaCl,8M脲)。(加入溶液比例,1g沉淀加入溶液4-5ml。)
8) 把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎,超聲3S,間隔8S。超聲10Min。
9) 破碎的液4℃13000rpm離心10分鐘,取上清,再次4度13000rpm離心10分鐘,取上清。
10) 在做可溶性蛋白純化時,沉淀中有,但是上清沒有的情況下,取沉淀,直接從(5)步驟往下操作。

包涵體蛋白的純化

  1. 平衡緩沖液:pH8.0的50mM Tris緩沖液含0.05M NaCl,8M脲。
  2. 洗脫緩沖液:①pH8.0的50mM Tris緩沖液含0.05M NaCl,8M脲,含20mM咪唑
    ②pH8.0的50mM Tris緩沖液含0.05M NaCl,8M脲,含50mM咪唑
    ③pH8.0的50mM Tris緩沖液含0.05M NaCl,8M脲,含100mM咪唑
    ④pH8.0的50mM Tris緩沖液含0.05M NaCl,8M脲,含300mM咪唑
    ⑤pH8.0的50mM Tris緩沖液含0.05M NaCl,8M脲,含500mM咪唑。
  3. 取3-4ml鎳瓊脂糖凝膠FF,用洗瓶清水洗清柱子5次,用50ml平衡緩沖液平衡。
  4. 將柱子和上清充分結合,放置四維旋轉混勻器上孵育1-2h后拿出純化。
  5. 過柱,流出FT。
  6. 用20倍柱體積平衡緩沖液洗去未吸附的樣品,流速1-2ml/min,直到流出液,點樣G250顯示無藍色是開始洗脫柱子上吸附的蛋白。
  7. 用20mM,50mM,100mM,300mM咪唑濃度分階段洗脫柱子,洗脫5-10個柱體積左右(PS:蛋白吸附較多,則用多的洗脫液洗脫。),流速1-2ml/min,4ml/管收集。(收集蛋白起點的確定:紫外分光光度的示數上升較快、考馬斯亮藍G250點樣確定變藍色;收集蛋白終點的確定:考馬斯亮藍G250點樣無明顯藍色,紫外分光光度示數下降平穩。)
  8. 將收集的各濃度梯度洗脫下來的蛋白,取樣,跑SDS-Page。
  9. 根據SDS-Page電泳圖獲取目標蛋白所在咪唑濃度梯度,收集蛋白,透析獲的目標蛋白

常見問題及解決方案

  1. 蛋白不溶解或沉淀在柱子上:要留意緩沖液體的pH,根據蛋白的PI值確定緩沖液和洗脫液的pH值,通過增加鹽濃度,避免蛋白的非特異性吸附,蛋白洗脫時在柱中沉淀 ,變性條件下進行洗脫。以在離心管中結合、洗脫的小量批次方式進行純化,以避免局部蛋白濃度過高。
  2. 蛋白不吸附:這是最常見的,通常的原因有①是標簽不暴露,被折疊在蛋白的結構內,可以在變性的條件下去純化,②可以選擇作用力更強,配基密度更高的填料,通常鎳瓊脂糖凝膠作用力最強,如果蛋白分子量大可以選擇手臂長的填料,如鎳NTA瓊脂糖凝膠,填料的好壞可以看填料的顏色,顏色越深那配基密度越高,作用力也相應要強。③樣品的pH過低或者沉淀導致不能吸附,所以樣品和緩沖液的pH要盡量一致,避免沉淀。④加吐溫可以可以降低表面張力,同時也可以降低疏水相互作用力了,使蛋白不會因為別的作用力而被吸附到柱子上,同時增強了洗脫能力。⑤ 緩沖液條件不正確,檢查漂洗緩沖液的pH值和組成,確保體系中不含鰲合劑及還原劑。
  3. 難洗脫:如果穿透中目標蛋白明顯減少,而洗脫又沒有,取點填料加電泳緩沖液煮后離心跑電泳還是有目標蛋白,可以用更強的洗脫條件如500mM咪唑,如果還不能洗脫,可以直接用500mM咪唑加8M脲去洗脫。
  4. 目的蛋白與雜蛋白一起洗脫出來:①色譜柱載量相對過大,減少Ni-NTA樹脂或Ni-IDA樹脂用量;②雜蛋白與目的蛋白結合,共純化下來,加大漂洗緩沖液的鹽濃度,或增加去污劑濃度,加入乙醇/甘油以破壞蛋白之間的疏水作用。

 

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