免疫共沉淀概述

相關服務:Co-IP蛋白互作檢測服務
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免疫共沉淀(Co-IP)是利用抗原與抗體之間的專一性作用為基礎,用于研究蛋白質與蛋白質之間相互作用的經典方法。利用免疫共沉淀可以檢測兩個已知蛋白之間的相互作用,或者利用已知蛋白尋找與之相互作用的未知蛋白。相較于其他分子間相互作用檢測方法(GST pull down等),免疫共沉淀實驗的優勢在于蛋白的結合在細胞內完成,能夠反應天然狀態下的蛋白質相互作用,結果更加真實可靠。

實驗原理

免疫共沉淀原理

當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質相互作用被保留了下來,假如細胞內存在XY蛋白復合物,用X(X也稱為誘餌蛋白)的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內結合的蛋白質Y(Y也稱為靶蛋白)也被沉淀下來。因此在細胞裂解液中加入X的抗體沉淀蛋白X,隨后利用蛋白印跡(western blot,WB)檢測沉淀中是否存在蛋白Y,如果存在,則說明細胞內存在XY蛋白復合物,即蛋白XY存在相互作用。

Co-IP實驗流程

免疫共沉淀實驗流程為:收集蛋白樣品—誘餌蛋白抗體沉淀誘餌蛋白—SDS-PAGE分離蛋白—WB檢測是否存在靶蛋白。詳細實驗操作流程請至“免疫共沉淀實驗操作流程及注意事項”查看。
免疫共沉淀實驗原理

收集蛋白樣品

蛋白樣品通常通過裂解細胞得到。Co-IP實驗通常有兩種,一種為內源性蛋白相互作用驗證,另外一種為非內源性蛋白相互作用驗證,內源性相互作用是指兩蛋白相互作用在細胞內發生,即通過質粒共轉染的方式將兩種蛋白轉染至同一細胞內表達,表達完成后收集細胞進行裂解得到蛋白樣品。非內源性相互作用兩蛋白相互作用在細胞外發生,即將含有靶蛋白的動植物組織、器官進行預處理及細胞裂解獲得細胞裂解液,隨后將誘餌蛋白(通常為重組表達純化獲得)加入細胞裂解液中,得到蛋白樣品。

沉淀誘餌蛋白

利用磁珠偶聯抗體沉淀誘餌蛋白:在樣品中加入磁珠偶聯抗體,抗體會與誘餌蛋白結合,利用磁鐵將磁珠拉下,同時誘餌蛋白會一起被沉淀出來。如果存在與誘餌蛋白的相互作用的靶蛋白,也會被沉淀下來。如果沒有誘餌蛋白的特異性抗體,可以給誘餌蛋白加上標簽(Myc、HA、Flag等),然后利用標簽抗體沉淀蛋白。

SDS-PAGE及WB檢測

得到沉淀后,需要驗證沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE將蛋白復合物分離,隨后利用WB檢測是否存在靶蛋白(如果靶蛋白的分子量是已知的,可以直接用SDS-PAGE檢測是否存在靶蛋白)。

實驗對照設置

為了確保最終得到的結果是天然狀態下的相互作用,而不是由于某些方面造成的人工相互作用(也就是“假陽性”),在Co-IP的實驗設計過程中,需要設置正確的對照。
假設Co-IP實驗的實驗組為“磁珠+抗X抗體+靶蛋白X+目的蛋白Y”,則可能出現的“假陽性”及對應需要設置的實驗對照如下表所示:

可能出現的“假陽性” 需要設置的對照實驗
磁珠與蛋白X非特異性結合 “磁珠+抗體X+抗體Y”
磁珠與蛋白Y非特異性結合 “磁珠+蛋白Y”
抗X抗體和Y非特異性結合 “磁珠+抗體X+蛋白Y”
抗X抗體(或磁珠)會和細胞裂解液內其它蛋白結合 “磁珠+抗體X+未轉染質粒的宿主細胞裂解液”
抗體的非特異性結合 “normal IgG+蛋白X+蛋白Y”

上述為了避免出現“假陽性”的對照稱為陰性對照,除此之外Co-IP實驗還會設置一個陽性對照組(Input組),Input組為直接利用抗體X(抗體Y)對細胞裂解液進行WB檢測,驗證細胞裂解液中存在蛋白X(抗體Y)。
在某些Co-IP實驗中,實驗人員會把IP后的上清分別進行蛋白X和蛋白Y的WB檢測,該對照組稱為output組。
利用內源性Co-IP實驗為驗證兩個蛋白是否存在已知作用,如果最終的結果為陽性,則可以證明兩個蛋白之間存在相互作用;但如果結果為陰性,無法證明兩個蛋白之間不存在相互作用,也有可能是蛋白在細胞內表達量低等原因導致。因此在進行內源性Co-IP驗證兩個蛋白是否存在相互作用時,建議先做過表達Co-IP作為對照。

免疫共沉淀結果真實性

在免疫共沉淀實驗中要保證實驗結果的真實性,應注意以下幾點:

  • 確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體具有特異性強、可大量生產、易標準化等優點,使用單克隆抗體有助于避免污染的發生;
  • 要確保抗體的特異性,如果抗體不能和細胞溶解物中的抗原結合,則不會引起共沉淀反應;
  • 確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中,而不是由于細胞的溶解才發生的。

免疫共沉淀技術應用

免疫共沉淀實驗可以用于:

  • 測定兩種目標蛋白質是否在體內結合
  • 確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔
  • 分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物

隨著對蛋白質研究的不斷深入,人們將免疫沉淀方法與其他方法結合起來,在其基礎上衍生出許多較為復雜的技術,從而使得分析方法更為多樣化,它的應用范圍也相當的廣泛。免疫共沉淀是用來研究蛋白質與蛋白質相互作用的一種技術,可以應用于蛋白復合物的研究。它可驗證蛋白復合物的存在,進而發現新的蛋白復合物;免疫共沉淀技術與免疫印跡法或質譜等方法結合,用于確定誘餌蛋白-目的蛋白在天然狀態下的結合情況,確定特定蛋白質的新作用搭檔。免疫共沉淀實驗也可以應用于低豐度蛋白的富集和濃縮。
同時免疫共沉淀技術是一個相對比較經典的探討蛋白質間相互作用的技術,在現代醫學研究中應用范圍廣泛且可信度較高。蛋白質之間相互作用滲透于機體每一個細胞的生命活動過程中,生物學中會出現很多現象如復制、轉錄、翻譯、剪切、分泌、細胞周期調控、信號傳導和中間代謝等都受到蛋白質間相互作用的調控。有些蛋白質由多個亞單位組成,蛋白質之間的相互作用就顯得尤為普遍。又有些蛋白質結合得十分緊密;而有些蛋白質卻只有短暫的相互作用。可是不論出現哪些種情況,它們都控制著大量的細胞生命活動的事件,比如細胞的增殖、分化和死亡。且通過蛋白質之間的相互作用,能改變細胞內蛋白質的動力學特征,比如底物結合特性、催化活性,也可以產生新的結合位點,對改變蛋白質對底物的特異性有作用,還可以使其他蛋白質失活,其他基因表達得到調控。因此,只有讓蛋白質之間相互作用得以順利進行,細胞的正常生命活動過程才會得到保障。因為蛋白質之間相互作用具有如此重大的意義,所以它的檢測方法的研究也備受關注與重視。自此以后蛋白相互關系的研究會愈演愈烈,未來不僅僅可以通過免疫共沉淀技術來證實,還將會有越來越多的先進技術值得去應用和發展。

其他相互作用檢測方法

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